Scientific Reports volume 13、記事番号: 10907 (2023) この記事を引用
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クライオイメージングは、動物モデルにおける蛍光細胞またはミクロスフェアの生体内分布を研究するために効果的に使用されています。 連続的なスライスごとの蛍光イメージングにより、蛍光細胞またはミクロスフェアの検出が可能になり、組織内でのそれらの分布の対応する定量化が可能になります。 ただし、スライスが薄すぎると、データの過負荷が発生し、スキャン時間が長くなります。 スライスが厚すぎると、細胞が失われる可能性があります。 この研究では、最適なスライス厚の決定を支援するために、蛍光細胞またはマイクロスフェアを検出するためのモデルを開発しました。 重要な要素には、切片の厚さ (X)、蛍光細胞の強度 (Ifluo)、有効組織減弱係数 (μT)、および検出閾値 (T) が含まれます。 このモデルは、スキャン時間を最小限に抑えながら理想に近い感度を提供する最適なスライス厚の値を提案します。 このモデルは、画像データが過度に厚いスライス厚で取得された場合に、欠落した細胞を補償するための補正方法も提案します。 このアプローチにより、クライオイメージングオペレーターはより大きなスライス厚を使用して、細胞数を大幅に損なうことなくスキャン時間を短縮できます。 私たちは、ブタ心臓の蛍光ミクロスフェアとマウスモデルの蛍光標識幹細胞という 2 つの独立した研究から得られた実際のデータを使用してモデルを検証しました。 結果は、シミュレーションと実際のデータからのスライス厚と検出感度の関係が 99% の相関と 2% の二乗平均平方根 (RMS) 誤差でよく一致していることを示しています。 また、蛍光強度の変動や空間分布など、モデルの重要な前提が満たされない状況での検出特性についても説明しました。 最後に、適切な設定により、クライオイメージングにより、非常に高い回収率 (検出数/送達) で蛍光細胞の体内分布を正確に定量化できることを示します。 クライオイメージング技術は多くの生物学的用途で使用されているため、当社の最適なスライス厚の決定およびデータ補正方法は、その使いやすさと信頼性をさらに向上させる上で重要な役割を果たすことができます。
クライオイメージングは、単一細胞感度でマウスまたはラット全体のあらゆる場所の蛍光細胞の局在化を可能にする 3D 顕微鏡イメージング技術です1、2、3、4、5、6、7、8、9。 このシステムは、電動ミクロトームクライオスタット、明視野および蛍光能力を備えた顕微鏡、ロボットポジショナー、および制御ソフトウェアで構成されています。 クライオイメージングを実行するには、対象の組織を液体窒素を使用して急速冷凍し、切片作成ステージに固定し、切片作成とイメージングを交互に行います。 このシステムは、組織のタイル状の広い視野、高解像度 (~ 10 µm)、カラー明視野画像および蛍光画像を取得します。 画像スライスを積み重ねることにより、生体内分布の視覚化と分析のために 3D 画像ボリュームを生成できます。 これらの卓越した機能により、磁気共鳴画像法 (MRI) や生物発光画像法 (BLI) などの他の 3D in vivo モダリティと比較して、クライオ イメージングが独特なものになっています。 このような生体内画像化モダリティは動物全体を画像化することができるが、十分な解像度が不足しており、グレースケール画像しか生成できない。 前述の機能により、クライオイメージングは他の生物学研究イメージングモダリティにおける重大なギャップに対処します。
クライオイメージングは、小型げっ歯類を含むさまざまな動物モデルにおける蛍光細胞またはミクロスフェアの生体内分布を研究するために使用されています2、3、4、6、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 、20、イヌ7、21、ブタ5、22、23、およびその他の動物モデル24。 Burden-Gulley ら 13、14、15 は、凍結イメージングを使用して、マウス モデルにおける神経膠芽腫細胞の移動および浸潤挙動を視覚化しました。 最近、我々はマウス全身の蛍光転移を定量化して評価するためのクライオイメージングベースのプラットフォームを開発しました4、17、18、19。 このプラットフォームは、転移性がんの検出、理解、治療に不可欠な技術のパイプライン（イメージング剤、イメージング方法、治療薬、腫瘍モデルなど）の評価と最適化に適していることが判明しました。 私たち自身のグループ 5,26 を含む多くのグループ 7,8,24,25 は、蛍光微小球捕捉法を介して定量的で高解像度の 3D 心筋灌流を空間的に分解する技術を採用しました。 ELのヴァン・ホーセン。 また、この技術を使用して、蛍光ミクロスフェア 7、21、22、23、27 と蛍光標識単球 6 の両方の生体内分布を視覚化し、動物の心臓における冠状動脈新生血管形成の進行の特性を調査しました。 さらに、我々は以前、クライオイメージング技術を使用して、移植片対宿主病（GVHD）マウスモデルにおいて静脈内注射された幹細胞と疾患誘発性免疫細胞の全身生体内分布を研究しました2,3,9,10,11,12。 、20、28、29。 ミクロスフェアシグナルと幹細胞シグナルを示す蛍光画像の例は補足文書に示されています。 生物医学イメージング研究におけるクライオイメージングの有用性の高さを考慮して、この技術を利用するアプリケーションはますます多くなってきています。
100 µm) is often chosen. The benefits of a larger section thickness include faster imaging and computing times, less memory usage, and longer life for the sectioning knife. However, signals of dimly fluorescent cells embedded in a thick tissue may not reach the surface and may not be detected by the imaging system. The physics of signal loss can be described by the principles of light absorption and scattering in the biological tissue30,31,32,33. In general, by setting a slice thickness that is too large, a significant rate of false negatives can be expected. This would render the results unreliable, particularly in applications that demand accurate absolute quantification. On the other hand, if one sets the slice thickness to be too small, although accurate quantification can be obtained, it would not be computationally or economically efficient. For example, a tissue which can be imaged overnight (12 h) at 120 µm slice thickness will take 3 days (72 h) to scan at 20 µm. There is expected to be an optimal value for slice thickness that will give accurate cell/microsphere counting at a reasonable scan time./p> 20 µm, the number of detected cells will be less than the true number of cells in the tissue as shown in Fig. 3. This situation leads to false negatives. Next, we will propose a mathematical model of the relationship between the fluorescent cell detectability and the slice thickness especially in the sub-optimal range (X > Xoptimal)./p> Xoptimal), the number of detected cells decreases as the slice thickness increases. By formulating the mathematical relationship, one can predict the cell loss and even estimate a correction factor to compensate for the under-sampling. In this section, we aim to construct the relationship under some simplifications./p> Xoptimal (which implies e/X < 1.0), the number of observed cells (n) is reduced from the total cells in the sample (N) according to the relative distribution, d(x), of cells lying in a given slice. The distribution of cells is therefore also related to the probability of a cell being at a given distance, p(x). This can be formulated as/p> Xoptimal), the detection sensitivity decrease as the slice thickness increases. Also, remind that for all X values that are less than or equal to Xoptimal, the Sens value will be 100%. By combining X values from both ideal range (X ≤ Xoptimal) and sub-optimal range (X > Xoptimal), we obtain:/p> Xoptimal) would adversely affect the sensitivity. Three cell intensities were chosen for this simulation: Ifluo = 30, 50 and 80 (grayscale intensity). The numbers were chosen from the intensity distribution of cells derived from our stem cell imaging database. Parameters T and μT were set to 10 (gray level) and 314 cm−1, respectively. The detection threshold value (T) was empirically estimated based on the signal-to-noise-ratio (SNR) in our image data. The value of μT was estimated from mouse tissues in our database using an exponential fitting method proposed by Steyer et al.34. The programming platform used in this study was Matlab 2022a (MathWorks, USA)./p> Xoptimal), the curve appeared as the reciprocal function derived in Eq. (14). By showing the relationship on a log–log scale, the relationship is shown to be perfectly linear (Fig. 6B), as predicted by the mathematical derivation described in Section “In silico simulations for non-compliant situations”./p> Xoptimal)./p> Xoptimal) (Fig. 10C,D)./p> Xoptimal). After running in silico simulations based on the assumptions, we made the following observations. When X ≤ Xoptimal, the Sens value was constant at 100%, but when X > Xoptimal, it decreased as a non-linear function of X (Fig. 6A). The relationship in the sub-optimal range was shown to be a reciprocal function of X Eq. (14). When plotted on a log–log scale, the relationship was linear with a slope of -1 (Fig. 6B). We speculate that this relationship would hold true for real data if the fluorescent cells behaved in a manner that was consistent with our key assumptions. Please note that we also developed a probabilistic model to predict the sensitivity profile in cases where the cell distribution is not uniform Eqs. (7)–(10) and with varying intensity Eqs. (16)–(17)./p> Xoptimal). In many applications, it is necessary for cryo-imaging users to choose a larger slice thickness in order to analyze a large piece of tissues such as pig hearts5,22,23,27, dog hearts7,21, or rabbit tissues24. As the sample volume is prohibitively large, a much larger slice thickness should be selected in order to efficiently optimize the imaging time, the memory space, and other costs. However, the larger the slice thickness beyond the Xoptimal value was, the higher the number of false negatives. In order to mitigate this issue, we propose that the relationship derived in Eqs. (14)–(15) can be used to estimate the true number of cells/microspheres. For example, if researchers conducted a microsphere biodistribution study in a large animal and needed to set a large slice thickness, say X = 100 μm while Xoptimal = 58 μm. By doing so, the cell signals acquired in their image data could be obtained with the sensitivity of only 58% (42% lost) as suggested by Eqs. (14)–(15). For correcting this, one may consider multiplying the number of found microspheres by a factor of 1/Sens (1/0.58 in our example) for estimating the true number of fluorescent microspheres in the tissue. This knowledge allows cryo-imaging operators to use larger slice thickness (much larger than Xoptimal) without significant loss of the microspheres. Such corrections could enable reduced scanning time of a large tissue such as a pig heart, going from days or weeks to hours or days. This finding makes that analyses feasible that may not previously be otherwise./p>
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